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　　elisa試劑盒操作方法、ELISA測定出現(xiàn)問題及解決

　　雙抗體夾心法

　　1.包被：用0.05MPH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10μg/ml。在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml，4℃ 過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。(簡稱洗滌，下同)。

　　2.　加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37℃ 孵育1小時(shí)。然后洗滌。(同時(shí)做空白孔，陰性對(duì)照孔及陽性對(duì)照孔)。

　　3.　加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體(經(jīng)滴定后的稀釋度)0.1ml。37℃ 孵育0.5～1小時(shí)，洗滌。

　　4.　加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃ 10～30分鐘。

　　5.　終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。

　　6.　結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+"、“-"號(hào)表示。也可測OD值：在ELISA檢測儀上，于450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍，即為陽性。

　　間接法

　　1.用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg/ml，每孔加0.1ml，4℃過夜;

　　2.次日洗滌3次;

　　3.加一定稀釋的待檢樣品(未知抗體)0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,置37℃孵育1小時(shí),洗滌;

　　4.(同時(shí)做空白、陰性及陽性孔對(duì)照)于反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體(抗抗體)0.1ml;

　　5.37℃孵育35-60分鐘，洗滌;

　　6.’最后一遍用DDW洗滌。

　　其余步驟同“雙抗體夾心法"的4、5、6。

　　ELISA測定中可能會(huì)出現(xiàn)的問題及可能的原因：

　　可能的原因(非試劑盒本身的原因)

　　1.弱陽性質(zhì)控樣本檢測不出 溫育的時(shí)間或溫度不夠;顯色反應(yīng)時(shí)間太短;所用配制緩沖液的蒸餾水有問題

　　2.測定的重復(fù)性差 (相同樣本兩次測定結(jié)果不一致) 這是典型的由測定操作引起的問題，包括

　　(1)加樣本及試劑量不準(zhǔn);孔間不一致;

　　(2)加樣過快，孔間發(fā)生污染;

　　(3)加錯(cuò)樣本;

　　(4)加樣本及試劑時(shí)，加在孔壁上部非包被區(qū);

　　(5)不同批號(hào)試劑盒中組分混用;

　　(6)溫育時(shí)間、洗板、顯色時(shí)間不一致;

　　(7)孔內(nèi)污染雜物;

　　(8)酶標(biāo)儀濾光片不正確;

　　(9)血清標(biāo)本未凝固即加入，反應(yīng)孔內(nèi)出現(xiàn)纖維蛋白凝固或殘留血細(xì)胞，易出現(xiàn)假陽性反應(yīng)等。

　　3.白板 (陽性對(duì)照不顯色)

　　(1)漏加酶結(jié)合物;

　　(2)洗板液配制中出現(xiàn)問題，如量筒不干凈，含酶抑制物(如疊氮鈉)等。

　　(3)漏加顯色劑A或B;

　　(4)終止劑當(dāng)顯色劑使用。

　　4.全部板孔均有顯色

　　(1)洗板不干凈;

　　(2)顯色液變質(zhì);

　　(3)加底物的吸光受酶污染;

　　(4)洗板液受酶等污染

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