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本生資訊:考馬斯藍(lán)染料原理、使用步驟匯總
更新時(shí)間:2023-05-16瀏覽:812次

  本生資訊:考馬斯藍(lán)染料原理、使用步驟匯總


  考馬斯藍(lán)染料簡(jiǎn)介:

  考馬斯藍(lán)廣泛用于瓊脂糖或丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)的可視化。

  考馬斯亮藍(lán)R250(紅色染成藍(lán)色)電泳(更靈敏:可以檢測(cè)到0.1微克蛋白質(zhì)),考馬斯藍(lán)G250(淺綠色藍(lán)色)用于溶液中的蛋白質(zhì)分析(方便-可溶)。兩者都可以用于每種應(yīng)用中,但是它們可以互換使用,因?yàn)樗鼈兛梢詫⒌鞍踪|(zhì)染色成不同的強(qiáng)度和顏色。

  考馬斯藍(lán)染料技術(shù)說(shuō)明:

  考馬斯藍(lán)R-250和G-250染料是考馬斯染料的兩種最常見(jiàn)的化學(xué)形式,是二磺化的三苯基甲/烷化合物。R-250(紅色)缺少以G-250(綠色)形式存在的兩個(gè)甲基。“250"最初表示染料的純度。

  考馬斯藍(lán)染色原理:

  不同的顏色是染料分子不同帶電狀態(tài)的結(jié)果。

  當(dāng)pH值小于0時(shí),考馬斯藍(lán)G250染料會(huì)腐蝕所有帶正電荷的三個(gè)氮原子,顏色為紅色最大吸收波長(zhǎng)為465nm。當(dāng)pH值約為1時(shí),染料的總電荷為+1(2-磺酸基團(tuán)帶負(fù)電,因?yàn)樗鼈兊膒Ka極低),所以染料是綠色的,具有吸收能力最大值為620nm,而pH值高于2時(shí),染料為亮藍(lán)色,最大值為595nm。在pH值為7時(shí),二苯/胺部分帶正電荷,總電荷為?1,染料消光系數(shù)為43 000 M?1厘米?1.

  染料與蛋白質(zhì)的氨基和羧基(非共價(jià))靜電相互作用,因此主要來(lái)自堿性氨基酸(主要是精氨酸、賴(lài)氨酸、組氨酸),以及疏水性氨基酸(苯丙氨酸,酪氨酸、色氨酸)。當(dāng)在pH=3.0的0.01M檸檬酸鹽緩沖液中溶解時(shí),考馬斯的最大吸收波長(zhǎng)為555nm;蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物的特征是峰略寬于游離染料的峰,最大值為549nm。

  考馬斯凝膠染色劑和布拉德福德蛋白質(zhì)分析試劑是以25-50%甲醇中的極酸性溶液配制的。在酸性條件下,染料主要通過(guò)堿性氨基酸(主要是精氨酸、賴(lài)氨酸和組氨酸)與蛋白質(zhì)結(jié)合,而絡(luò)合物的形成穩(wěn)定了產(chǎn)生藍(lán)色的染料的負(fù)電荷陰離子形式。每個(gè)蛋白質(zhì)分子結(jié)合的考馬斯染色配體的數(shù)量約為與蛋白質(zhì)上發(fā)現(xiàn)的正電荷數(shù)成正比。蛋白質(zhì)結(jié)合導(dǎo)致染料從紅棕色至亮藍(lán)色(最大吸收波長(zhǎng)為595nm)。

  考馬斯藍(lán)G-250染料的水溶性在膠體考馬斯染色方案中得到了很好的應(yīng)用。

  溶液中蛋白質(zhì)測(cè)定-布拉德福德法

  1. 著色溶液成分:5%考馬斯藍(lán)G250

  2. 著色溶液制備:

  a.將50mg考馬斯藍(lán)G250溶于50ml甲醇中

  b.從步驟1開(kāi)始向溶液中加入100ml 85%H3PO4

  c.將步驟2的溶液加入500ml H2O中,混勻

  d.過(guò)濾以去除任何沉淀物

  e.再添加350ml H2O和miw 儲(chǔ)存于4°C。

  3. 分析流程20-150 µg 蛋白; 200-1500 µg/mL

  a. 準(zhǔn)備0.15M NaCl溶液稀釋至最終濃度為250、,500、750和1500微克/毫升濃度。同時(shí)準(zhǔn)備待測(cè)樣品稀釋液。

  b. 向單獨(dú)的試管(或分光光度計(jì)試管)中添加100µL蛋白至以上濃度NaCl稀釋液中。

  c. 再向每個(gè)試管中添加5.0mL考馬斯藍(lán),通過(guò)渦流或倒置進(jìn)行混合。

  d. 將分光光度計(jì)調(diào)整到595nm的波長(zhǎng),并使用不含蛋白質(zhì)的試管進(jìn)行空白。

  e. 等待5分鐘,在595nm波長(zhǎng)下讀取每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)和每個(gè)樣品。

  f. 繪制標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度與蛋白濃度的關(guān)系。計(jì)算消光系數(shù)并計(jì)算未知樣本的濃度。

  考馬斯藍(lán)染料本生一直視質(zhì)量控制為企業(yè)的生命,追求企業(yè)競(jìng)爭(zhēng)力的不斷提升。公司在經(jīng)營(yíng)中始終秉承:遵紀(jì)守法,嚴(yán)于律己,寬仁以待,敢于承擔(dān)的企業(yè)精神作為標(biāo)準(zhǔn),以過(guò)硬的質(zhì)量和優(yōu)良的服務(wù)來(lái)維護(hù)和拓展市場(chǎng),較大限度的滿(mǎn)足客戶(hù)的需求。與客戶(hù)的共贏,是我們的發(fā)展目標(biāo)。本生!您信任的合作伙伴。我們?cè)概c您真誠(chéng)合作,共創(chuàng)美好的未來(lái)。


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